Forum Technologia Żywności Strona Główna Technologia Żywności
Technologia Żywności i Żywienie Człowieka Szczecin 2005-2009
 
 FAQFAQ   SzukajSzukaj   UżytkownicyUżytkownicy   GrupyGrupy    GalerieGalerie   RejestracjaRejestracja 
 ProfilProfil   Zaloguj się, by sprawdzić wiadomościZaloguj się, by sprawdzić wiadomości   ZalogujZaloguj 

Elektroforeza na koło

 
Napisz nowy temat   Odpowiedz do tematu    Forum Technologia Żywności Strona Główna -> Biotechnologia
Zobacz poprzedni temat :: Zobacz następny temat  
Autor Wiadomość
agatab40



Dołączył: 30 Mar 2007
Posty: 10
Przeczytał: 0 tematów

Ostrzeżeń: 0/5

PostWysłany: Śro 7:19, 16 Maj 2007    Temat postu: Elektroforeza na koło

Elektroforeza żelowa

W elektroforezie żelowej środowiskiem w którym przemieszczają się badane substancje jest żel elektroforetyczny wykonany z agaru, poliakrylamidów lub skrobi (metoda historyczna), uformowany w płytkę długości kilkunastu centymetrów (rzadziej słupek - elektroforeza dyskowa). Kroplę roztworu analizowanej mieszaniny nanosi się w zagłębienie w żelu (studzienkę) zanurzonym w buforze pH. Wzdłuż krawędzi żelu, zwykle na dwóch przeciwległych bokach płytki, biegną elektrody, do których przykłada się stałe napięcie elektryczne rzędu 50- 2000 V. Ze względu na zróżnicowaną ruchliwość elektroforetyczną, różne cząsteczki w różnym stopniu oddalają się podczas analizy od miejsca naniesienia próby. Stopniowo ulegają więc rozdzieleniu.


Technika ta jest najczęściej stosowana do rozdzielania DNA, RNA lub białek wyekstrahowanych z komórek. Jest też czasami stosowana jako jedna z technik pomiaru masy cząsteczkowej i badania polidyspersji polimerów syntetycznych. Jeśli badaczowi zależy na ograniczeniu wpływu kształtu cząsteczek na szybkość ich elektroforetycznej wędrówki i na ściślejszym powiązaniu ich ruchliwości z masą cząsteczkową, to może badane substancje poddać denaturacji, np. przy pomocy detergentu SDS (w przypadku białek) lub mocznika (w przypadku DNA lub białek).
Elektroforeza - technika stosowana przy rozdziale , analizie i oczyszczaniu kwasów nukleinowych i białek.

DNA i RNA mają ładunek ujemny i zgodnie z tym ładunkiem , nadawanym przez grupy fosforanowe , migrują w polu elektrycznym w kierunku anody. Szybkość migracji zależy od wielkości i kształtu cząsteczki.
Schemat postępowania jest następujący : żel ulega zestaleniu w formie cienkiej płytki na podstawce tzw. saneczkach wraz z zanurzonym specjalnego typu grzebieniem , który następnie wyciąga się. W zastygłym żelu znajduje się szereg dołków , do których wprowadzane są próbki DNA oraz z reguły tzw. standard czyli mieszanina cząsteczek o znanych masach dzięki czemu możliwa będzie później kalibracja żelu. Przed naniesieniem na żel próbki muszą być odpowiednio przygotowane : dodawany jest barwnik , który informuje nas później jak daleko zaszły najszybsze cząsteczki (co jest niezbędne ponieważ DNA w żelu nie widać) oraz związek interkalujący - bromek etydyny , który fluoryzuje w świetle UV co pozwoli nam na zlokalizowanie prążków.

Minimalna ilość DNA , którą widać na żelu w postaci prążka to 20 ng. Ilość DNA w prążku nie powinna przekraczać 200 ng ponieważ obserwuje się przeładowanie kieszonki. Żel umieszczony zostaje w specjalnym aparacie do elektroforezy i zalewany buforem przewodzącym prąd. Podłączony zostaje do zasilacza generującego prąd o stałym i określonym napięciu i natężeniu. Jakość rozdziału fragmentów DNA zmniejsza się w miarę zwiększania napięcia w czasie elektroforezy. Dla otrzymania optymalnej jakości stosuje się napięcie nie większe niż 5V na 1cm długości żelu.
Kalibracja wielkości fragmentów cząsteczek w żelu opiera się na zasadzie , że liniowe cząsteczki DNA migrują w żelu agarozowym z prędkością odwrotnie proporcjonalną do logarytmu dziesiętnego ich masy cząsteczkowej wyrażonej w Daltonach lub w tysiącach par zasad czyli kb. Kalibracja żelu polega na wykreśleniu krzywej zależności odległości przebytej w czasie elektroforezy przez poszczególne fragmenty od logarytmu masy cząsteczkowej.
Elektroforezę można przeprowadzać w żelach natywnych lub denaturujących.

1. Żele agarozowe.
Metoda szybka , prosta , powszechnie stosowana. Zdolność rozdzielcza zależy od wielkości porów w żelu , których rozmiary są zdeterminowane przez stężenie agarozy. Żeli bardziej stężonych tj. 1,4-2,0 % używa się do rozdziału cząsteczek mniejszych (0,5-2,0 kb). Żele mniej stężone 0,5-0,7 % stosuje się do rozdziału cząsteczek większych (10-20 kb i więcej).
Zaletą może być niekiedy fakt , że podczas elektroforezy możliwe jest rozdzielenie cząsteczek o tej samej wielkości ale zróżnicowanych pod względem kształtu. Doskonałym przykładem jest rozdział trzech różnych form plazmidu : CCC (ang. covalently closed circle) , liniowej i OC (ang. open circle). Pierwsza najszybciej wędruje w żelu , druga nieco wolniej , trzecia najwolniej.

2. Żele akrylamidowe.

Powstają przez polimeryzacje monomerów akrylamidu w długie łańcuchy z wytworzeniem wiązań poprzecznych przez bisakrylamid. Można regulować sieciowanie poprzez manipulację proporcjami stężeń akrylamidu do bisakrylamidu. Do zajścia reakcji niezbędna jest obecność odpowiedniego katalizatora (PERS - nadsiarczan potasowy) i związku inicjującego reakcję (TEMED). Żele te stosuje się przy rozdziale fragmentów o wielkości od kilku par zasad (20% poliakrylamid) do tysiąca par zasad (3% poliakrylamid) a także przy rozdziale jednoniciowych cząsteczek DNA np. do sekwencjonowania.

3. Żele denaturujące.

Ponieważ szybkość migracji w żelu jednoniciowych cząsteczek , zależy nie tylko od ich wielkości i ładunku ale także w dużym stopniu od ich struktury przestrzennej (w przypadku dwuniciowych cząsteczek DNA nie ma to większego znaczenia) aby dokładnie określić ich wielkość należy weliminować różnice w szybkości migracji wywołane różną konformacją cząsteczki. Jest to szczególnie ważne w przypadku jednoniciowego RNA , które tworzy miejscowe struktury dwuniciowe. W tym właśnie celu stosuje się żele denaturujące agarozowe lub poliakrylamidowe. Najczęściej używanymi czynnikami denaturującymi są : formaldehyd i glioksal w żelach agarozowych (przy analizie preparatów RNA) lub mocznik w żelach poliakrylamidowych (przy analizie jednoniciowych fragmentów DNA).

4. Elektroforeza w polu pulsacyjnym.

Stosowana do rozdzielenia dużych cząsteczek DNA - od 2.104 do 107 bp czyli od 20 kb do 10 Mb. Można w ten sposób rozdzielić całe chromosomy np. drożdżowe. Pole elektryczne jest włączane i wyłączane w krótkich odstępach czasu. Kiedy pole elektryczne jest włączone cząsteczki migrują zgodnie ze swoją wielkością a gdy zostaje wyłączone mają tendencję do relaksacji i zwijania w przypadkowe pętle. Czas wymagany do relaksacji jest wprost proporcjonalny do długości cząsteczki. Następnie kierunek pola elektrycznego jest zmieniany o 90 lub 180 stopni w stosunku do poprzedniego. Dłuższe cząsteczki zaczynają poruszać się wolniej niż krótsze. Powtarzające się zmiany kierunku pola stopniowo powodują rozdzielenie.

IZOLACJA Z ŻELU CZYLI JAK ODZYSKAĆ DNA.

Izolacja z żelu jest niezbędnym etapem w szeregu doświadczeń. Jest konieczna gdy po rozdziale pragniemy wykorzystać do dalszej pracy pewną określoną frakcję materiału lokującego się w odpowiednim prążku.
Istnieje wiele metod odzyskiwania DNA z żeli jednak żadna z nich nie jest pozbawiona wad.
Istotne problemy przy izolacji to :

- obecność inhibitorów reakcji enzymatycznych np. obecne w agarozie zanieczyszczenia w postaci polisacharydów , które hamują aktywność enzymów używanych przy dalszej obróbce klonowanego DNA
- niezbyt duża skuteczność odzyskiwania dużych fragmentów DNA ponieważ wydajność izolowania jest funkcją ciężaru cząsteczkowego tych fragmentów , za wielkość graniczną dla dobrej izolacji przyjmuje się długość 5 kb
- im mniejsza ilość DNA na żelu tym mniejsza wydajność jego odzyskiwania , izolacja staje się nieskuteczna przy ilościach mniejszych niż 500 ng
- nie ma możliwości izolacji jednocześnie kilku fragmentów o różnej długości.
Metody :

1. Izolacja DNA z użyciem DEAE-celulozy.

Polega na przyczepieniu się migrującego DNA do umieszczonej w żelu membrany z DEAE-celulozą , którą następnie odpłukuje się z zanieczyszczeń buforem o niskiej sile jonowej a potem eluuje z niej DNA buforem o wysokiej sile jonowej. Należy pamiętać , że z membran nie podlega elucji jednoniciowe DNA oraz fragmenty powyżej 15 kb.

2. Elektroelucja do woreczków dializacyjnych.

Najefektywniejsza do izolacji dużych fragmentów DNA - powyżej 5 kb. Po odpowiednim rozdzieleniu wycina się konkretny prążek DNA , umieszcza w woreczku dializacyjnym , który wkłada się do aparatu do elektroforezy i prowadzi ją przez jakiś czas po czym na krótko odwraca się bieguny i prowadzi elektroforezę przez minutę co pozwala na uwolnienie DNA ze ścian woreczka. Woreczek dializacyjny zostaje przepłukany odpowiednim buforem i po dodaniu kilku specjalnych odczynników i wirowaniu otrzymujemy preparat DNA.

3. Metoda "freeze-sqeeze".

Jest to bardzo szybka metoda izolacji. Tak jak poprzednio po elektroforezie zostaje z żelu wycięty konkretny prążek. Fragment żelu umieszczony w probówce , na dnie której znajduje się niewielka ilość silikonowej szklanej waty , zamraża się w ciekłym azocie (freeze) a następnie wkłada się jedną probówkę w drugą po zrobieniu w tej pierwszej niewielkiego otworku na dnie. Kolejnym etapem jest wirowanie (sqeeze). Uzyskany w ten sposób bufor poddaje się jeszcze kilku zabiegom wytrącania i wirowania , po których otrzymujemy wyizolowane DNA.


Post został pochwalony 0 razy
Powrót do góry
Zobacz profil autora
gostek
Gość





PostWysłany: Czw 20:26, 17 Maj 2007    Temat postu:

Ma ktos cos wiecej na koło z Biotechnologi prosze o szybka odpowiedz
Powrót do góry
Wyświetl posty z ostatnich:   
Napisz nowy temat   Odpowiedz do tematu    Forum Technologia Żywności Strona Główna -> Biotechnologia Wszystkie czasy w strefie CET (Europa)
Strona 1 z 1

 
Skocz do:  
Możesz pisać nowe tematy
Możesz odpowiadać w tematach
Nie możesz zmieniać swoich postów
Nie możesz usuwać swoich postów
Nie możesz głosować w ankietach

fora.pl - załóż własne forum dyskusyjne za darmo
Powered by phpBB © 2001, 2005 phpBB Group
Regulamin