Technologia Żywności

Monia

TECHNIKI FINGERPRINTING

Konwencjonalne metody różnicowania w obrębie gatunku mimo utrwalonych zalet obarczone są licznymi ograniczeniami, związanymi z niską siłą dyskryminacyjną, czy brakiem powtarzalności.
Zaletą technik molekularnych jest:
skrócenie czasu wykonywanych analiz, zmniejszenie kosztów,
pracochłonności,
a także uniwersalność stosowanej aparatury i odczynników w porównaniu z metodami klasycznymi.

Jednak decydujące znaczenie dla wiarygodności badań ma wybór odpowiedniej metody genotypowania i interpretacja wyników
Podstawą technik typowania wewnątrzgatunkowego=fingerprinting jest ujawnienie polimorfizmu
-Polimorfizm objawia się charakterystycznym dla każdego izolatu obrazem produktów
amplifikacji lub też obrazem wzorów restrykcyjnych.
- Do zmian sekwencji matrycy DNA może dojść wskutek wielu zdarzeń genetycznych,
takich jak: mutacje punktowe, inwersje, delecje, czy inne reorganizacje nabyte w
ciągu życia osobniczego

POLIMORFIZM DNA
W obrębie DNA można wyróżnić rozrzucone w całym genomie, powtarzające się wiele razy sekwencje nukleotydów, które zależnie od długości powtarzającego się docinka i częstości jego powtórzeń nazywamy:
- Minisatelitarnym DNA zawierającym sekwencje tandemowych VNTR
(ang.variable number oftandem repeats=liczba powtorzen tandemowych)
- Mikrosatelitarnym DNA, zawierającym sekwencjami STR (ang. short tandem
repeats= sekwencj e mikro satelitarne) to sekwencj e zawieraj ące od 10 - 5O powtórzeń motywu o długości do 6 par zasad.
Na podstawie różnic występujących w tych obszarach oparte są wszystkie metody fingerprinting. Techniki fingerprinting sprowadzają się do dwóch podstawowych strategii:
>- Pierwsza z nich opiera się na analizie polimorfizmu długości fragmentów
restrykcyjnych DNA (RFLP, PFGE)

>- Druga dotyczy analizy produktów łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR - Polimerase
Chain Reaction).
Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych może dotyczyć:
- chromosomalnego DNA (REA - Restriction Endonucleasis Analysis),
- Genomowego DNA (RFLP - Restriction Fragment Lenght Polymorphism,
polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych),
- analizy makrorestrykcyjnej (PFGE - Pulse-Field Gel Electrophoresis, elektroforeza w zmiennym polu elektrycznym),
- plazmidowego DNA (REAP - Restriction Endonuclease Analysis ofPlasmid DNA),
- czy poszczególnych genów (PCR-RFLP, polimorfizm długości fragmentów
restrykcyjnych produktów PCR).
PCR - fingerprinting
Strategia tych metod opiera się na amplifikacji nieznanych sekwencji, polimorficznych DNA . z użyciem "przypadkowych"starterów.
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) najczęściej stosowana, wykorzystywana do wykrywania polimorfizmu pomiędzy blisko spokrewnionymi izolatami/szczepami/osobnikami wśród różnych populacji tego samego gatunku. Wzory amplifikacji powstają przy zastosowaniu pojedynczego starteru o wielkości ok. 10 p.z. oraz niskiej temperatury wiązania starterów. Wielkość otrzymywanych fragmentów waha się od kilkuset do ok. 2-2,5 tys. p.Z. Najczęściej uzyskiwany jest niski stopień skomplikowania profilu amplifikacji (ok. 10 produktów).
AP-PCR (Arbitrarily Primed PCR) stosowane są dwa dłuższe, różne startery (ok. 20 p.z.), a profil amplifikacji jest bardziej złożony niż w reakcji RAPD (średnio od 10-ciu do kilkunastu produktów)
DAF (DNA Amplification Fingerprinting
Stosowany jest krótki primer (5-8 p.z.) w stężeniach lO-krotnie wyższych niż w technikach AP-PCR i RAPD, a stopień skomplikowania profilu jest bardzo wysoki.
FINGERPRINTING
Zalety:
- uniwersalność,
- nie jest konieczna wiedza o budowie badanych genomów,
- spełnia wymagane kryteria typowalności,
- możliwości dyskryminacyjne określane jako nieograniczone,
- niskie koszty analiz

PROBLEMY:
- można stwierdzić, że dwa różne wzory produktów PCR - fingerprinting
reprezentują różne szczepy (organizmy),
- nie można stwierdzić, że dwa iednakowe wzory reprezentuią ten sam szczep
( organizm),
- im więcej prążków we wzorze, tym pewniejsza diagnoza,
- im więcej przebadanych przypadków, tym pewniejsza diagnoza
ZASADY PRACY TECHNIKAMI FINGERPRINTING:
:; Optymalizacja!
- zastosowanie identycznej metody i warunków izolacji matrycowego
DNA,
- używanie jednakowej ilości (stężenia) matrycy DNA w każdej reakcji,
- używanie tych samych odczynników w całej serii doświadczeń,
- używanie tego samego sprzętu (np. termocyklera) w całej serii doświadczeń.
Pulsed Field Gel Electrophoreasis- PFGE

:; elektroforeza w zmiennym polu elektrycznym
:; "złoty środek"
:; trudna
:; praco- i czasochłonna
:; droga
W doświadczeniach mających na celu typowanie mikroorganizmów bardzo cenne okazuje się zastosowanie analizy restrykcyjnej. Technika ta polega na poddaniu nienaruszonego totalnego DNA genomowego trawieniu enzymatycznemu z zastosowaniem restryktaz. Liczba i wielkość otrzymywanych fragmentów DNA determinowana jest przez ilość i rozmieszczenie sekwencji rozpoznawanych przez enzym restrykcyjny. Rozdział dokonuje się wagarozowej elektroforezie pulsowej (PFGE - pulsed field gel electrophoresis)
Jest to odmiana elektroforezy w żelu agarozowym pozwalająca na rozdział i analizę DNA wielkocząsteczkowego (20kb-2Mb). Ocenę stopnia podobieństwa izolatów wykonuje się
rozdzielając strawione DNA chromosomalne w zmiennym polu elektrycznym. DNA chromosomalne izolowane jest po zatopieniu komórek mikroorganizmu w bloczkach agarozowych (aby zapobiec mechanicznemu pofragmentowaniu) i w tej formie poddawane trawieniu restrykcyjnemu a następnie rozdziałowi elektroforetycznemu. Enzymy restrykcyjne do trawienia DNA chromosomalnego dobiera się z grupy tzw. restryktaz rzadkotnących, rozpoznających długie sekwencje nukleotydowe i generujących 17-30 fragmentów DNA. Warunki elektroforezy zależą przede wszystkim od wielkości oczekiwanych fragmentów DNA oraz ich ilości
PFGE pozwala na powtarzalne uzyskiwanie profili restrykcyjnych odzwierciedlających całość chromosomu bakteryjnego. Ponieważ pojedyncze mutacje/ rearanżacje mogą występować w genomach poszczególnych izolatów tego samego klonu, przyjęto iż za szczepy podobne uznaje się izolaty, których wzory restrykcyjne nie są identyczne. Prace porównawcze ujawniły konieczność unifikacji systemu interpretacji uzyskiwanych wzorów restrykcyjnych. Najpopularniejszy jest system zaproponowany przez Tenovera i wsp. (1995), zgodnie z którym wyróżniono:
szczepy nierozróżnialne - brak różnic we wzorze,
szczepy blisko spokrewnione - 3 różnice lub mniej,
szczepy potencjalnie spokrewnione - 4-6 różnic,
szczepy niespokrewnione - powyżej 6 różnic.

Technika ta stosowana jest m.in. w typowaniu szczepów pochodzących z zakażeń szpitalnych. Wydaje się, że jest techniką najlepszą z dostępnych; zapewnia uzyskiwanie łatwych do porównania wzorów DNA w sposób powtarzalny niezależnie od rodzaju mikroorganizmu (co czyni ją przydatną do analizy wszystkich mikroorganizmów, z których możliwe jest wyizolowanie DNA odpowiedniej jakości). Wszystkie szczepy są dzięki niej typowalne. Liczne badania porównawcze wykazały wyższość tej metody w zestawieniu
z innymi technikami molekularnymi i klasycznymi.

Za wady PFGE należy uznać pracochłonność i czasochłonność (minimalny czas oznaczenia to 7 dni), konieczność posiadania dobrze wykwalifikowanego personelu oraz dobrego zaplecza molekularnego, kosztowność odczynników i sprzętu. Dodatkowo, w każdym przypadku konieczna jest optymalizacja techniki przy typowaniu nowych gatunków mikroorganizmów, a część z nich (np. Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori) wymaga nietypowych procedur izolacji DNA. Wadą metody jest również częste zachodzenie i pokrywanie się fragmentów DNA o zbliżonej wielkości, co powoduje, iż otrzymany obraz elektroforetyczny staje się trudny w interpretacji. Otrzymane wzory restrykcyjne mogą także zostać zafałszowane przez fragmenty pochodzące z plazmidowego DNA, izolującego się łącznie z DNA chromosomalnym